酶**分析（EnzymeImmunoassay,EIA）是標記**分析中的一項重要技術,是以酶標記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應的特異性和酶催化底物反應的高效性和專一性結合起來的一種**檢測技術。作為經典的三大標記技術之一,酶**技術在檢驗醫學中得到廣泛應用并不斷得到更新，不斷和其他先進技術如熒光、發光技術以及儀器自動化相融合，日臻完善,許多自動化儀器實際上是EIA技術和其他現代化技術的復合體，其分析敏感度已達到甚至大大超過放射**分析(Radioimmunoassay,RIA)的水平，因試劑穩定無放射性污染且分析形式日趨多樣化，簡易靈活，臨床應用廣泛而倍受重視。

一、酶**分析的技術進步

近年來，EIA技術取得了顯著的發展，主要表現在以下方面：

1、繼單克隆抗體后的第三代抗體基因工程抗體的應用，明顯地提高了檢測的特異性，基本消除了抗原、抗體間的非特異**叉反應，保證了分析的準確性?？贵w制備技術的進步，使試劑的生產制備得以規?；瑱z測范圍日益擴展，小分子抗原、半抗原的檢測成為事實。

2、 分析方式的改進與多樣化提高了試驗的敏感性。

（1）除早期的競爭法，間接法外，又發展了雙抗原夾心法測抗體，偶聯酶標記法測抗原，橋聯酶**分析，酶放大**分析技術等，后者應用了生物素-親和素系統，底物循環放大系統，酶-抗酶放大系統及酶偶聯放大系統等。

（2）由于酶標記技術的進步，標記酶的應用已從過氧化物酶，擴展到堿性磷酸酶，β半乳糖苷酶，尿素酶，葡萄糖6磷酸脫氫酶，葡萄糖氧化酶，蘋果酸脫氫酶，至今有二十多種酶被應用于EIA，但應用*多的仍然是辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）和堿性磷酸酶（Alkalinephasphotase，ALP）。

（3） 酶**分析與其它標記**分析相結合如與熒光**分析（Fluorescence Immunoassay,FIA）結合形成熒光酶**分析（Fluorescence Enzyme Immunoassay，FEIA），酶促放大時間分辨熒光**分析（Enzyme-am-plified time-resolvedfluoroimmunoassay ，EATRFIA），EIA與化學發光**分析（Chemiluminescenceimmunoassay，CLIA）結合形成酶—化學發光**分析，增強化學發光酶**分析（ECLEIA）。EIA與聚合酶鏈反應結合形成的PCR-EIA分析等。

（4）改進固相載體的技術

傳統ELISA應用的固相載體是聚苯乙稀微孔板，聚苯乙烯珠或條，后發展為硝酸纖維素膜、活化濾紙、硅片、尼龍、利用高分子材料合成的各種固相微粒等。為提高固相表面的結合容量，增加結合物的范圍而改造聚苯乙烯的表面，如用化學偶聯法導入功能性醛基、酰基、烷胺基等以更好地與蛋白質，多肽的羧基結合，用位點導向性共價偶聯法引入親和素，蛋白A，多聚賴氨酸等，以牢固地捕獲蛋白或多肽，超平整聚苯乙烯表面的制備，克服了表面粗糙帶來的不均一性，達到平均粗糙度只有2A+的超平整平面，實現了對蛋白的結合容量大，脫附率低，孔間均一性好，使試驗精密度達5%。應用于雙抗體夾心法時，聚苯乙烯經射線照射后，可以增加其吸附性能特別是對**球蛋白的吸附性能。近年美國Corning公司研制成功表面經琥珀酰亞胺酯活化酶標板，其質量達到氨基活化相似水平。

（5）分析方法的**如同步ELISA法測定多種抗體是將抗原包被在與微孔相匹配的釘板的釘子上，蓋上釘板的同時與微孔內的所需標本、試劑反應，是又一種改良ELISA。利用抗體和抗抗體能形成多層復合物的特性，將常規二步溫育法改為一步溫育測定法，使檢測時間大為縮短，現在已廣為應用。
 

二、酶**分析在方法學上與現代化技術的融合發展

酶**測定具有高度敏感性、特異性，而且它的試劑比較穩定，操作簡單且無放射性危害，更由于現代生物學技術的發展，抗原抗體制備和酶標記技術的完善，特別是商品試劑盒的標準化和自動化儀器的應用，使其成為一種適用于各級檢驗部門的**標記技術。隨著檢驗醫學的不斷發展，酶**測定不斷與現代化技術的融合中得到發展。

1、斑點-ELISA斑點-ELISA的原理與ELISA的區別在于用對蛋白質有極強吸附力的硝酸纖維素膜代替塑料制品作為固相載體，酶作用底物后在硝酸纖維素膜上形成有色沉淀而使膜著色。它的靈敏度較一般ELISA高6～8倍、可達ng水平，試劑用量小，不需其它設備條件。

2、**印跡法**印跡法是將電泳與ELISA結合起來的一種方法，分為電泳、轉印、酶**測定三個階段。**印跡法結合了電泳的高分辨率和酶**測定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣品組分的**學測定方法。

3、發光酶**測定發光酶**測定與一般EIA的區別是酶所催化的底物是發光劑。產物不是一般EIA的有色物質，而是發光產物，所發出的光可用特定的儀器測定。常用HRP和AP作為標記酶與其發光底物作用進行分析。

4、增強發光酶**分析　增強發光酶**分析(enhaned luminescene enzyme immunoassay,ELEIA)是EIA技術的新發展。其特點是酶促增強發光信號，并穩定和延長發光信號時間。既保持發光**分析的高靈敏度，又克服了傳統發光酶**分析所發信號時間短的缺點，目前國外已實現自動化分析。

5、BAS-酶聯**吸附試驗BAS-酶聯**吸附試驗是將生物素-親和素（BAS）放大系統與ELISA結合起來的一種技術。生物素（B）有兩個環狀結構，其中一個可以和親和素結合，另一個可以和包括酶、抗原（抗體）的多種物質結合。親和素（A）有4個可與生物素穩定結合的亞基，此為放大系統的關鍵，即有1個親和素就能結合4個生物素，親和素也可被酶標記。

在BAS的應用中正是利用了生物素和親和素的這些特點，設計了兩類反應類型：一類是以游離親和素為“橋”，分別連接生物素化抗原抗體反應系統和酶標生物素。此種類型有BAB法和ABC法，另一類是直接用標記親和素連接生物素化抗原抗體反應系統，此種類型有BA法。這種通過BAS放大作用可將更多的酶聚集在固相載體上，使酶**技術檢測的靈敏度進一步得到提高。

6、酶促熒光放大**分析技術（Fluorescence Enzyme Immunoassay,FEIA）原理是利用具有潛在熒光的底物作為酶標物催化放大的顯示系統，由于累積放大和熒光的高敏感性，使方法學的靈敏度提高很多。

7、酶促放大時間分辨熒光**分析（EATRFIA）其突出特點是引入了時間分辨熒光**技術，有利于排除特異熒光的干擾，并經酶促信號放大，增強了測量的特異性。
 

三、 酶**分析技術的自動化

20世紀50年代生化自動分析儀就取得實際應用。由于酶**測定技術上的特殊性，直到20世紀80年代后才有自動化分析系統問世，目前我國全自動酶標儀市場基本上被進口品牌獨占天下。按分析過程的不同，酶**測定可分為均相（homogenous）和異相（heterogenous）兩大類。

1、均相酶**測定及其自動化均相酶**測定也稱非固相或液相**測定，用于小分子物質特別是**濃度的測定。模式為競爭法，即標記的抗原與標本中的抗原競爭結合特異性抗體，然后進行標記物的測定。在特定的情況下，與抗體結合的標記物失去其特性，因此不需將結合的（B）和游離的（F）分離即可直接測定F中標記物的量。

1972年Syva公司開發的酶擴大**測定技術（Enzyme-multiplied immunoassaytechnique，EMIT）和1992年Microgenics公司開發的克隆酶供體**測定（Clone enzyme donorimmunoassay，CEDIA）均屬均相酶**測定，這兩種方法的試劑在生化自動分析儀即可進行標本的檢測。因而專用于EMIT和CEDIA的全自動分析儀較少。

2、異相**測定及其自動化

大部分標記**測定均屬異相。*常用的B和F的分離手段為固相載體的洗滌，但在臨床化學測定中無此步驟。70年代初，Engvall和Perlaman等學者**創建非均相酶**測定技術，也稱固相酶**測定即酶聯**吸附劑測定（Enzymelinked immunosorbentassay），通用的名稱為ELISA，在ELISA中通常用聚苯乙烯為固相載體，有微孔板、小管、小珠、微粒、磁性微粒等類型。不同形式的固相載體要求不同的洗滌裝置。因此異相**測定的自動化不能借助于生化自動分析儀，各種方法均有其特殊的自動分析系統，下面作幾方面介紹。

（1） 微孔板式自動分析儀

不同廠家生產的板式ELISA試劑種類繁多，但均采用規格統一的8×12的96孔微板。因此儀器廠生產的板式ELISA自動分析儀均為"開放式"的，即適用于各家的試劑產品。微孔板每一孔的徹底清洗是ELISA的關鍵，亦是自動分析的難點。因此直至近年才有全自動的板式酶免分析儀問世。Bio-Rad公司的CODA自動酶**分析儀以及更為智能化的EVOLIS酶免分析儀、Dynex公司的DSX、DIAS、DiasUltrs全自動酶標分析系統均可同時進行多塊微板的全自動測定。Bio-Tek公司的Fastrack智能型酶標板處理系統可與寶特系列讀板機、洗板機和液體處理系統聯合使用。Tecan公司的大型全自動酶免一體機--瑞士TECAN，為全自動平臺，雙機械臂同時工作，全部過程無須人工干預，全自動微板處理系統RMP（RoboticMicroplateProcessor），能夠完成從標本分配到*后結果的全部過程，適合于中大規模具有多種實驗項目的實驗室。經過幾年的發展許多板式酶免分析儀已經具備真正意義上的全自動分析處理無人職守系統。MicrolabF.A.M.E全自動酶免處理系統是瑞士HAMILTON公司生產的一套完全自動化的酶標處理系統,它可以執行ELISA試驗中所有必需的處理步驟,同時該儀器也是一套開放系統,可同時處理各個廠商的不同ELISA試驗項目,具有操作靈活簡便,處理能力大及日常維護方便等特點，是目前比較不錯的一套系統。

（2）其他形式固相載體的自動分析儀

微孔板以外的固相載體形式，其自動分析系統均為試劑與儀器配套型的。

管式載體的特點是小管可同時作反應和比色的容器。如BoehringerMannheim公司開發的ES300型分析儀、ES600型全自動EIA分析儀屬此種類型，但自該公司并入Roche公司以后，各型ES儀器已停止生產。

Abbott公司*早采用0.6cm直徑的小珠作為載體，小珠放在相應大小的塑料孔盤中滾動沖洗，屬半自動類型。Roche公司的COBASCOREⅡ自動分析儀則采用粒徑較小的小珠為固相載體，以辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體，以TMB為顯色底物，可檢測40多個項目，為全自動的分析系統。

Abbott公司應用膠乳微粒作為載體的MEIA（微粒子酶**測定）自動分析系統較小珠型更為先進，膠乳微?？晌皆诓ＡЮw維膜上進行洗滌。這種自動分析系統稱為IMx，現在與TDx合并組成全能型的Axsym系統。

磁性微粒表面積大，可用磁鐵吸引進行分離，是較為理想的載體。瑞士Serono公司的SEROZYME型酶**分析儀屬此類型。這種載體已被其他標記**測定所采用。
 

四、酶**分析技術和其他分析技術在自動化儀器中的聯合應用

1、化學發光酶**測定

這是采用化學發光劑作為酶反應底物的酶標記**測定。經過酶和發光兩級放大，具有很高的靈敏度。Amersham公司早期開發了以過氧化物酶為標記酶、以魯米諾為發光底物、并加入發光增強劑以提高敏感度和發光穩定性的化學發光酶**測定系統AMERLITE，經Johnson& Johnson 公司改良后商品名為VITROSEci全自動任選式增強化學發光**分析系統，此儀器將酶**技術，生物素親合素技術和增強化學發光技術相結合。以辣根過氧化物酶標記抗原或抗體，以塑料小孔管為固相載體，魯米諾為化學發光劑。關鍵技術是應用了發光增強劑，使發光強度增加千倍，時間延長且穩定。美國貝克曼庫爾特公司(BecmanCoulter)的Access全自動微粒子酶放大化學發光**分析系統,該系統是由美國貝克曼公司和法國巴斯德研究院合作設計生產的。該系統以堿性磷酸酶標記抗原或抗體、以磁性微粒子為固相載體,用AMPPD(Diomums)作為化學發光劑,這種化學發光劑發光穩定、持續時間長,因此比閃爍發光容易控制。類似的分析系統有DiagnosticProduction Corporation公司的IMMULITE2000型，全自動任選式酶標記抗原或抗體，以AMPPD（Dioxeten）作為發光物，以塑料珠為固相載體。測定原理與貝克曼公司的Access基本相同。

2、酶促熒光放大**分析技術

法國梅里埃公司的VIDAS全自動熒光酶標**測試系統，系統采用雙抗夾心法以堿性磷酸酶標記抗原或抗體,用塑料吸管(SPR)為固相載體,以4-甲基傘型酮磷酸鹽(4-MIjP)為發光劑、美國Nexct公司的AuraFlex采用磁珠法和標記酶直接催化發光底物發光（AKP標記，4-MUP為底物）。

3、酶促放大時間分辨熒光**分析（EATRFIA）美國MD公司(Molecular DevicesCorporation)的微孔板式熒光酶標儀SPECTRAmax瓽EMINIXS，是**應用雙單色光連續波長系統于微孔盤，熒光、冷光和時間分辨熒光三合一的機型。能從事終點測讀、動力學測讀、光譜掃描和細胞計數實驗，采取多項設計，降低激發光反射的干擾，微孔盤塑料、樣品組成物和溶劑（包括水）本身含有的螢光物干擾。

4、微粒子酶**分析技術（Microparticle enzymeimmunoassay,MEIA）方法科學、試劑儀器穩定、靈敏度高、定量線性范圍寬等優點，如美國Abbott公司IMX全自動**熒光分析儀，反應*終形成微粒上包被的抗體-被測物-堿性磷酸酶標記的二抗夾心復合物，將其轉移到玻璃纖維柱上用緩沖液洗滌,再加入底物進行測定，有配套試劑供應。Abbott公司的AXSYM全自動快速**分析系統，該系統綜合使用了微粒子捕捉酶**分析技術(MEIA)、熒光偏振**分析技術(F凹的,可測定**、腫瘤標志物、肝炎、病毒標志物、維生素和各種****濃度等)。
 

五、酶**分析的局限性

1、酶**分析檢測的特異性實際上決定于單克隆抗體所針對的抗原決定簇。因而受試劑中包被所用抗原抗體的純度、特異性，酶標記物的穩定性、特異性、純度、親和力以及制備工藝等諸多因素的影響，故對檢測試劑盒應嚴格比較和選定。固然，其他標記**分析方法也有此類問題，但EIA試劑盒的供應廠商數量*多，應予注意。

2、在酶**分析測定結果中目前所測的胰島素或C肽，近年發現是該物質及其前體的混合物就是受抗體局限的明顯例子，是由于有交叉的抗原性而難以分開，因此通常檢測的只能稱為“**反應性”胰島素或C肽，這使得我們需重新評價過去對所測的胰島素或C肽的認識，并致力于“真”或“純”胰島素、C肽的測定，類似的情況可能還會發現。

3、酶**分析以固相反應為主，在測定中要注意克服固相不同部位包被抗原（抗體）量不一致引起的表面效應，溫育時要防止邊緣孔與中心孔反應條件不一致引起的邊緣效應，以及抗原、抗體間比例不匹配可能引起的鉤狀效應，必須引起注意的是操作簡易的“一步法”常比“二步法”易發生鉤狀效應。

4、固相材料存在非特異性吸附，標本溶血或冰箱貯存可釋放過氧化物酶，冰箱貯存時間過長可導致血清IgG聚合，均容易引起本底偏高，甚至嚴重干擾測定。需要指出的是隨著技術進步和儀器自動化程度越來越高，這些缺陷在自動化程度較高的儀器和工作量較大的實驗室中已不十分明顯，但在半自動化儀器和標本量少需冰箱貯存時，這些缺陷還是顯而易見的。總之，隨著科學發展和技術**，酶**分析技術必將越來越完善，自動化程度越來越高，準確度和精密度越來越好，定將為人類的健康事業作出更大的貢獻。